什么是TaqMan?分子诊断的“八倍镜”!
发布时间:2022-05-24 18:49:17 作者:万博bob官方在线 来源:万博bob体育链接

  提到实时荧光定量PCR(简称qPCR),想必大家都很熟悉,它是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质,利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用荧光化学物质的不同,qPCR可分为荧光染料法(SYBR Green Ⅰ法为代表)和荧光探针法(TaqMan法为代表)

  SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用简便,价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性,即染料可以与任何dsDNA结合。因此,qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值,影响定量结果的准确性,而TaqMan探针法的出现解决了染料法非特异性的问题。

  TaqMan®检测作为荧光定量PCR金标准长久以来被广泛应用。与染料法实时PCR不同,TaqMan®检测中会增加荧光探针成分,探针通过荧光共振能量转移(FRET)发生作用。

  在 PCR 开始之前,TaqMan® 探针完整且具有一定的灵活性。探针完整时,报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力,可促进 FRET 的发生。在 PCR 开始之前,报告基团信号被淬灭。

  Taqman探针法荧光定量PCR,通过在常规的PCR体系中引入一条Taqman探针来进行实时荧光检测。这条Taqman探针是一条寡核苷酸,其能够结合到PCR正反向引物结合区域的内部,随着PCR反应的进行,DNA聚合酶在延伸到探针位置会将其水解,从而产生信号。因此Taqman探针属于水解探针的重要成员之一。

  Taqman探针的5端标记有荧光基团,3端标记有相应的淬灭基团。由于Taqman探针长度的限制,当探针完整的时候,荧光基团处于淬灭基团的淬灭范围内,荧光大部分被淬灭基团吸收或转换为别的波长的光,此时仪器检测不到相应的荧光值。

  在PCR退火过程中,探针优先结合到待扩增区域,然后DNA聚合酶从引物位置开始延伸,一直延伸到探针位置,此时DNA聚合酶的5-3核酸外切酶能够将Taqman探针水解。水解之后,荧光基团脱离了淬灭基团的束缚,释放出强烈的荧光,从而被仪器检测到。

  并不是任意一段序列都适合作为Taqman探针,其设计要掌握以下几个原则:

  Taqman探针的长度最好在25-32bp之间,且Tm值在67-72℃之间,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,在退火过程中优先结合到模板上。

  ● 探针序列要与模板能够完全互补配对,探针尽量避免出现二聚体或者高级结构,以保证足够高的模板结合效率。

  ● 探针的5端最好紧邻对应引物(结合同一模板链的那条引物)的3端,这样能够保证在PCR扩增时第一时间将探针水解释放荧光信号。

  ● 探针两端的各两个碱基不能为G,即使单独的G碱基也会对荧光基团产生淬灭作用,从而影响荧光或者淬灭效率。

  ● 整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量,较多的G会产生高级结构,对探针的合成以及使用产生负面效果。

  如果熟练掌握了上述设计原则,也可以通过其他工具,如Primer 3,Primer Premier、Oligo甚至NCBI都可以进行引物和探针的设计。优秀的探针序列是得到精准结果的前提。

  Taqman探针的另一精华在于修饰基团,在选择修饰基团时,需要注意以下几点:

  ●根据荧光定量PCR仪选择适配的荧光基团,优先选择常用的荧光基团,如FAM(FITC)

  (5-FAM和6-FAM为同分异构体,与FITC在与Oligo的连接方式上不同,但其发光基团均为荧光素,因此使用上没有区别。图片来源于网络)

  ●根据荧光基团的种类进行淬灭基团的搭配。早期的淬灭基团多为TAMRA或者DABYCL,但TAMRA自身也会发出荧光干扰检测,而DABYCL的淬灭范围非常有限,极大地限制了Taqman探针的使用。目前淬灭基团最常用的是Biosearch Technologies公司的黑洞系列淬灭基团(Black Hole Quencher,BHQ)。

  下表为大家列出了常用荧光基团的发光信息及搭配的淬灭基团,方便大家进行选择。

  上图(来源于Sigma)显示了FAM和CY3荧光基团分别选择TAMRA、DABCYL、BHQ1、BHQ2作为淬灭基团的信噪比,从中可以看出,FAM-BHQ1和CY3-BHQ2是其中的最佳搭配。

  ●不建议在中间标记淬灭基团,有些客户担心探针太长,荧光基团离淬灭基团太远降低淬灭效率,但是有文献指出,这两者的距离并不是越近越好。更重要的是,3端标记淬灭基团同时起到了封闭探针3-OH的作用,使得探针无法参与扩增,这一点对于探针来说非常重要。如果一定要设计在中间,则必须在3端进行封闭修饰。

  相比于染料法荧光定量PCR,Taqman法通过探针的引入,极大提升了qPCR反应的特异性。即使引物有二聚体或者非特异性条带扩增,由于没有探针的参与水解,也不会产生荧光信号,不会对定量产生影响。

  探针法的另一个优点是可以做多重qPCR,能够同时检测多个指标的含量。在保证足够的扩增效率的情况下,有的研究者会将两套甚至更多引物和探针置于一个qPCR体系中,通过探针标记的荧光基团不同,分别检测相应的荧光信号变化。这样极大节省了qPCR酶的用量,降低了成本。并且某些检测,如SNP的探针法检测,是一定要使用不同的探针在统一体系下进行检测的。

  探针成本较高,有时设计的探针不合适,有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。高昂的价格是限制探针法应用的最主要因素之一。

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