免疫细胞化学技术
发布时间:2022-06-15 14:52:54 作者:万博bob官方在线 来源:万博bob体育链接
  声明:,,,。详情  免疫细胞化学,又称免疫组织化学,其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经过化学的呈色反应后,用显微镜或电子显微镜观察。  免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋
 

  声明:,,,。详情

  免疫细胞化学,又称免疫组织化学,其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经过化学的呈色反应后,用显微镜或电子显微镜观察。

  免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或

  · 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:

  – 免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

  – 完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。

  · 免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

  – 半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。

  · 通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

  – 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。

  – 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5~25个分子的小肽。

  · 机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。

  – 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

  ·单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

  · 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

  – 抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒。

  – 常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。

  · 一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长滞留时间,且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中,常将抗原和佐剂一起注射。

  –弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant)

  – 弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant)

  · 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或5:1,可根据需要而定,通常2:1。

  · 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

  弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA)

  · 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2~20mg/ml),即成为FCA。

  · 免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。

  – 一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。

  – 先将不完全佐剂加热,取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。

  – 按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

  · 缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。

  – 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内,然后插入三通管内,交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。

  – 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液面下 0.5cm,离瓶底0.5cm左右,以免打碎离心管。

  – 每次乳化 10~15s,然后置冰箱lmin左右。反复乳化3~4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5~10min收集。

  · 判断乳化是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中),如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。

  – 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。

  – 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需10~100g抗原即可获得较好的免疫效果。

  – 用50~200g Ag加入FCA,在背部皮下注射6~8点,每点0.1~0.2ml,也可肌肉内或皮内注射;

  – 将50~200g Ag于PBS或FIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射;

  – 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上,后者在1:16以上,即可采血,取血清进一步提纯。

  – 10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大的淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化;

  – 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为25~50g;

  – 用10~100g Ag加入FCA,在背部皮内注射4~6点,每点 0.lml,也可肌肉内或皮下注射;

  – 每隔 7~8天,将10~50g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射;

  – 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内,使两者进行相互扩散,当抗原抗体浓度之比相适宜时,彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。

  · 在玻璃板上铺胶,约1.5mm 厚,凝固后打孔(直径 3rnm),孔间距10mm。

  · 中心孔加5l 抗原样品,周围孔内每孔加5l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。

  · 颈动脉放血法:放血量较多,动物不易中途死亡。例如:2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。

  · 心脏采血法:常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物,但操作不当易引起动物死亡。

  · 静脉采血:家兔可用耳缘静脉采血;山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血,这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液。

  · 血液凝固后,及时离心收集血清,否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解,降低效价;

  – 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性,既不淬灭、流失或弥散,也不被隐蔽。

  ·免疫组化的组织和细胞标本,制作流程与常规处理方法基本相同,但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。

  – 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验的最佳方法。

  – 最大优点是组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;

  ·石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响,但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。

  · 标本新鲜:一般在2h以内进行,超过2h,组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散。

  · 取材部位:除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。

  –细胞坏死后,不仅抗原弥散或消失,而且常引起非特异着色,干扰观察,因此取材时应尽可能避开坏死区。

  · 避免挤压:取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色,因而取材时应使用锋利的刀刃;

  – 固定使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应,防止组织自溶或异溶,以保持原有结构和形态;

  · 常用固定液:固定剂品种很多,但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同,各有优缺点。

  · 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

  · 改用中性缓冲,以pH值7.2~7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液,减少固定液pH的变化。

  – 穿透性强,微细结构保存好,但对抗原有一定影响,常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

  · 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

  ·脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

  · 乙醇使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。

  – 对抗原性的保存好,但脱水性更强,较少 用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定。

  · 要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。

  · 主要是通过一些酶的作用,使抗原决定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

  –胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37C,10~40min,主要用于细胞内抗原的显示;

  – 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.1%~0.4%,消化时间为37C、30~180min,主要用于细胞间质抗原的显示。

  · 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,加热至沸腾,持续10~15分钟。

  · 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上,持续l0~15分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行。

  · 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联的网链,使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短,对抗原再现效果好。

  · 将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压2~3min,可取得极好的效果。

  · 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中,室温作用20min(温度升高,作用时间缩短)。

  · 此法能增强特异性染色,降低背景,但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。

  · 加热后必须经过室温自然冷却20~30分钟,使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型;

  – 最新研究表明碱性修复液更有效,推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。

  ·抗原修复过程中,由于高温、高压等诸多固素的影响,极易造成脱片。为防止脱片,常用粘附剂处理载玻片。

  – 新载玻片上有油污,要用洗液浸泡12~24h,自来水冲洗后再用蒸馏水清洗;用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。

  · 取出稍停片刻,再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES,置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。

  · 将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释),37C放置30min,然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。

  · 先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中,再加入明胶及蒸馏水,可在70 C水浴中使明胶溶化,搅拌均匀后,即可使用。如有残渣,可过滤后再用。

  · 组织冻结过程中,细胞内、外的水分会形成冰晶,冻结的速度愈慢,冰晶颗粒愈大,可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。

  · 干冰中加入丙酮(或异戊烷),液体立即气化起泡,温度降至一70C ,将组织投入,若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器,组织投入该容器内结冻则更好;

  – 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内,以保护组织。

  – 制成冻块后若需保存,应以铝箔或塑料薄膜封包,贮存于-70 C冰箱。

  · 切片时,使用恒温冷冻切片机,在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4~8m。

  · 切好的冰冻切片,室温下自然晾干1~2h后,入4C丙酮固定10min,待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。

  · 冰冻切片由于切片技术要求较高,不易得到连续性很好的切片,其形态结构亦不如石蜡片,且冻块和切片不便于长期贮存,因此冰冻切片的应用受限。

  · 将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面,细胞即粘附于玻片,晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min,自然干燥后染片或-20℃保存。

  · 贴壁细胞培养时,置盖片于培养瓶中,使细胞在盖片上生长,达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10~20min),再进行免疫染色。

  · 将细胞浓度调节到106/ml左右,可直接涂于载玻片上,但要均匀、不重叠。

  · 将细胞样品制成2×105~6/ml 细胞悬液,吸取50~100l (1~2×104~5cells) 加入涂片机内,1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。

  ·荧光素经某种特定波长的光照射激发后,能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光,籍此可作定位观察或示踪;

  · (1)异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC)

  · (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)

  · 最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光谱为 520~530nm.呈翠绿色荧光,分子量 389.4。

  · 在碱性条件下,FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键,成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。

  · 最大吸收光谱550nm,最大发射光谱620nm,呈红色荧光,分子量为444。

  · 最大吸收光谱为570nm,最大发射光谱为595~600nm,呈橙红色荧光,分子量为580。

  · RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl),在碱性条件下,易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。

  · PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合,但对碱基无特异性选择。

  – 保存前需加防腐剂 (浓度为1:5000~10000的硫柳汞或1:1000~5000叠氮化钠) 。

  原理:将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。

  – 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min,然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次;

  – 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后,进行抗原修复,然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次;

  – 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释),放在湿盒中,37C孵育30min;

  · 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次,不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。

  – 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。

  · 缺点:敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。

  · 一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。

  – 染色温度:多采用室温(25C),高于37C可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C的低温,延长染色时间。

  – 自发荧光对照(空白对照):标本加0.01mol/L,pH7.4的PBS代替一抗。

  –特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。

  · 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。

  · 经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

   需要两种抗体参与,即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。

  – 加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7.4的PBS稀释),37C作用30min或4C过夜。

  · 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸,在摇床上漂洗);

  · 优点:敏感性较高,比直接法高10倍左右;制备一种荧光标记抗体,可应用于多种一抗;

  · 荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长 ,会使荧光减弱。

  · 一抗和二抗应始终保持在标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。

  · 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素,沉积于抗原和抗体反应的部位;

  ·辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物

  · 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物

  · HRP是应用最广的一种酶,来源于植物辣根,由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成,分子量约40kDa,稳定性好;

  –供氢体:多用无色的还原型染料,通过反应生成有色的氧化 型染料,最常用的供氢体是DAB。

  · DAB本身无色,反应后呈棕色,不溶于水,不易褪色,电子密度高,最为常用。

  – 偶氮偶联反应,底物为-萘酚磷酸盐,经水解后得-萘酚,与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀,分别呈兰色或红色。

  – 靛蓝-四唑反应:底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP),经酶水解并氧化形成靛蓝,而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。

  · 通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,与标本进行反应后,再用酶组化法将酶显色,使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。

  – 缺点:酶与抗体形成的共价键,可损害抗体和酶的活性;易产生非特异染色。

  · 将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。

  · 将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。

  – 冰冻切片浸入4C丙酮固定10min,0.01M PBST漂洗,5min×3;

  – 细胞爬片先用PBS洗,然后4C丙酮固定10min,再0.01M PBST漂洗,5min×3;

  · 封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5~10min (湿盒内) ;

  · 5~10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭,室温孵育30min (湿盒内) ;

  · 倾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗, 37C孵育60min 或4C过夜(湿盒内);

  · 加0.01%H2O2~0.05%DAB显色 (显色液应新鲜配置);

  · 经PBS漂洗3次后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,明胶甘油封片,显微镜观察。

  – 优点:任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害,提高了方法的敏感性,而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。

  · 一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些,使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。

  · 二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量,使其Fab段一个与一抗结合,另一个则游离。

  · 因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG,具有相同的抗原性,所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合,起桥作用,将其连接在与组织抗原结合的一抗上。

  · 与酶桥法相似,不同的是,PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步,用PAP复合物代替;

  · 显色与酶桥法相同,PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解,形成不溶性终产物。

  · PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。

  · 这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。

  · 生物素(biotin)又称维生素H,是一种小分子维生素,分子量为244,是转氨甲酰基化过程中的辅酶。

  · 抗生物素(avidin),又称卵白素或亲和素,是一种分子量为67000的碱性蛋白,对生物素具有很强的亲和力,比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成,每个亚基都有生物素的结合位点。

  · 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联,又可被酶类等多种示踪物所标记,形成生物素-抗生物素系统。

  – 该系统一端体系,另一端连结标记物,后者加入酶的底物,产生颜色反应。

  (1)标记抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB):分为直接法和间接法。

  用生物素标记第一抗体,与抗原结合;酶标记抗生物素,与生物素结合,然后进行酶呈色反应。

  用生物素标记二抗,酶标记抗生物素,先用第一抗体与组织抗原结合,再将第二抗体与第一抗体相连结,最后进行呈色反应。

  (2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method,BRAB)

  – 此法是用生物素分别标记抗体和酶,以抗生物素为桥,把二者连接起来,进行呈色反应。

  · ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上,再将其与过量的抗生物素反应而制备的。

  · 特异性强,背景染色淡:由于敏感性高,一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度,减少了非特异染色。

  · 由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫。

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